domingo, 6 de fevereiro de 2011
terça-feira, 1 de fevereiro de 2011
Sistema Imunitário
As proteínas que formam as cápsulas dos vírus são diferentes das proteínas existentes no corpo humano. Quando sofremos algum tipo de invasão por vírus, as proteínas desses seres - "estranhas" ao nosso organismo - são "detectadas" por certas células do corpo. Essas células fazem parte do sistema imunitário, que é o sistema de defesa do corpo, e passam então a produzir substâncias que combatem o vírus invasor: os anticorpos.
Quando alguém contrai um resfriado, por exemplo, o sistema imunitário inicia a produção de anticorpos. Depois de alguns dias, os anticorpos eliminam os vírus e a pessoa fica curada do resfriado.
Os anticorpos têm ação específica. Isso significa que eles atuam apenas no combate do microorganismo para o qual foram produzidos. No exemplo anterior, o anticorpo capaz de reagir ao vírus do resfriado não combate o vírus do sarampo, e vice-versa.
Mas afinal o que é o Sistema Imunitário???
O sistema imunológico, também conhecido como sistema imunitário, é constituido por diversos tipos de células e órgãos, que protegem o organismo dos animais de potenciais agentes agressores biológicos ou quimicos.
Assim, fazem parte do Sistema Imunológico os vasos linfáticos, os órgãos e tecidos linfóides e as células efectoras (leucócitos, macrófagos e plasmócitos).
Este sistema é não só responsável pela destruição de células envelhecidas e anormais (cancerosas), do próprio organismo como também a nossa defesa para que possamos mantermo-nos saudáveis, mesmo na presença de inúmeros agentes invasores conferindo imunidade, ou seja, protecção contra agentes patogénicos.
Os agentes patogénicos ou patogenes são os organismos causadores de doenças como os vírus, as bactérias, os fungos e os protozoários.
Devido ao facto de cada individuo ser único do ponto de vista bioquimico, o sistema imunitário é capaz de reconhecer aquilo que pertence ao organismo e o que lhe é estranho; isto é, na superficie celular, existem glicoproteínas que são diferentes das moléculas presentes nas células das outras espécies e mesmo de outros membros da mesma espécie.
As diferenças que existem entre as superficies celulares de cada organismo residem na variabilidade genética. De facto, a expressão de diferentes formas alélicas produz proteínas distintas, algumas das quais encontram-se na superficie das membranas celulares, funcionando como um sistema de identificação. Por esta razão, as glicoproteínas da superficie membranar, que permitem identificar uma célula como pertencente ou não a um determinado organismo, tomam a designação de marcadores. Estes marcadores são codificados por um conjunto de genes ligados que se encontram no cromossoma 6 e constituem o complexo maior de histocompatibilidade (MHC).
Quando o sistema imunitário detecta marcadores diferentes dos que são próprios do organismo, ou sinais de perigo, desencadeia uma resposta imunitária:
Mecanismos de defesa não especificos (promovem uma protecção geral contra os patogenes, destruindo a maioria deles):
- Barreiras fisicas: Mucosas e Pele
- Secreções: Muco, Lágrimas, Saliva, Secreções gástricas e Suor
- Fagocitose
- Resposta inflamatória
- Interferão
- Sistema de Complemento
Mecanismos de defesa especificos (é direccionada para um tipo particular de substâncias ou patogene que tenha conseguido entrar no corpo):
- Imunidade mediada por células
- Imunidade mediada por anticorpos
Assim, uma resposta imunitária é um conjunto de processos que permite ao organismo reconhecer a presença de substâncias estranhas ou anormais de forma a que sejam neutralizadas e eliminadas. Esta depende da comunicação entre as células - sinalização celular - em que um aspecto importante é o sinal de tradução, ou seja, a conversão de um sinal extracelular numa série de acontecimentos intracelulares.
Quando alguém contrai um resfriado, por exemplo, o sistema imunitário inicia a produção de anticorpos. Depois de alguns dias, os anticorpos eliminam os vírus e a pessoa fica curada do resfriado.
Os anticorpos têm ação específica. Isso significa que eles atuam apenas no combate do microorganismo para o qual foram produzidos. No exemplo anterior, o anticorpo capaz de reagir ao vírus do resfriado não combate o vírus do sarampo, e vice-versa.
Mas afinal o que é o Sistema Imunitário???
O sistema imunológico, também conhecido como sistema imunitário, é constituido por diversos tipos de células e órgãos, que protegem o organismo dos animais de potenciais agentes agressores biológicos ou quimicos.
Assim, fazem parte do Sistema Imunológico os vasos linfáticos, os órgãos e tecidos linfóides e as células efectoras (leucócitos, macrófagos e plasmócitos).
Este sistema é não só responsável pela destruição de células envelhecidas e anormais (cancerosas), do próprio organismo como também a nossa defesa para que possamos mantermo-nos saudáveis, mesmo na presença de inúmeros agentes invasores conferindo imunidade, ou seja, protecção contra agentes patogénicos.
Os agentes patogénicos ou patogenes são os organismos causadores de doenças como os vírus, as bactérias, os fungos e os protozoários.
Devido ao facto de cada individuo ser único do ponto de vista bioquimico, o sistema imunitário é capaz de reconhecer aquilo que pertence ao organismo e o que lhe é estranho; isto é, na superficie celular, existem glicoproteínas que são diferentes das moléculas presentes nas células das outras espécies e mesmo de outros membros da mesma espécie.
As diferenças que existem entre as superficies celulares de cada organismo residem na variabilidade genética. De facto, a expressão de diferentes formas alélicas produz proteínas distintas, algumas das quais encontram-se na superficie das membranas celulares, funcionando como um sistema de identificação. Por esta razão, as glicoproteínas da superficie membranar, que permitem identificar uma célula como pertencente ou não a um determinado organismo, tomam a designação de marcadores. Estes marcadores são codificados por um conjunto de genes ligados que se encontram no cromossoma 6 e constituem o complexo maior de histocompatibilidade (MHC).
Quando o sistema imunitário detecta marcadores diferentes dos que são próprios do organismo, ou sinais de perigo, desencadeia uma resposta imunitária:
Mecanismos de defesa não especificos (promovem uma protecção geral contra os patogenes, destruindo a maioria deles):
- Barreiras fisicas: Mucosas e Pele
- Secreções: Muco, Lágrimas, Saliva, Secreções gástricas e Suor
- Fagocitose
- Resposta inflamatória
- Interferão
- Sistema de Complemento
Mecanismos de defesa especificos (é direccionada para um tipo particular de substâncias ou patogene que tenha conseguido entrar no corpo):
- Imunidade mediada por células
- Imunidade mediada por anticorpos
Assim, uma resposta imunitária é um conjunto de processos que permite ao organismo reconhecer a presença de substâncias estranhas ou anormais de forma a que sejam neutralizadas e eliminadas. Esta depende da comunicação entre as células - sinalização celular - em que um aspecto importante é o sinal de tradução, ou seja, a conversão de um sinal extracelular numa série de acontecimentos intracelulares.
segunda-feira, 31 de janeiro de 2011
Os vírus
Os vírus são seres que não possuem células, são constituídos por ácido nucléico que pode ser o DNA ou o RNA, envolvido por um invólucro protéico denominado capsídeo. Possuem cerca de 0,1µm de diâmetro, com dimensões apenas observáveis ao microscópio eletrônico.
Por serem tão pequenos conseguem invadir células, inclusive a de organismos unicelulares, como as bactérias. É parasitando células de outros organismos que os vírus conseguem reproduzir-se. Como são parasitas obrigatórios eles causam nos seres parasitados doenças denominadas viroses.
Os vírus apresentam formas de organismo bastante diferenciadas, mas todos possuem uma cápsula feita de proteína, onde fica o material genético desses seres. Esse material genético sofre modificações, ou seja mutações, com frequência, levando ao surgimento de variedades (subtipos) de um mesmo vírus. Isso dificulta o seu combate e compromete a eficiência de várias vacinas, que são preparadas para combater tipos específicos de microorganismo. A capacidade de sofrer mutações genéticas é uma das características que os vírus têm em comum com os seres vivos.
Diferentes formas dos capsídeos dos vírus.
Os vírus só podem ser visualizados com o auxílio de microscópios eletrônicos, instrumentos disponíveis apenas em locais especializados, como centros de pesquisa, universidades e grandes laboratórios, e que podem mostrar imagens aumentadas em até centenas de milhares de vezes.
Imagem de um microscópio eletrônico mostrando o vírus HIV, formato circular.
Vírus e a saúde
A palavra vírus tem origem latina e significa "veneno". Provavelmente esse nome foi dado devido às viroses, que são doenças causadas por vírus.
O nosso corpo tem defesas naturais, como os anticorpos, que são proteínas produzidas por células especiais do sangue contra agentes causadores de doenças. A própria febre representa um mecanismo de combate as infecções, pois o aumento da temperatura ativa o metabolismo e acelera a reação dos glóbulos brancos. Quando a temperatura axilar ultrapassa 37,5 graus Celcius, porém, a pessoa deve ser tratada pelo médico. Além disso, contamos com produtos como vacinas, soros e alguns medicamentos antivirais (não confundir com antibióticos).
De modo geral, as viroses provocam mal-estar, dores e febre, mas cada virose tem seus sintomas próprios e pode ser mais ou menos grave.
Cada tipo de vírus "ataca" células específicas. O vírus da caxumba, por exemplo, parasita as células das glândulas salivares ou parótidas, provocando inchaço e dor nas laterais do pescoço.
Em algumas doenças, incluindo certas viroses, a transmissão depende da ação de um vetor. Esse termo se refere ao ser que não provoca por si mesmo a doença em outros seres, mas que, carrega no seu corpo o agente causador, podendo transmiti-lo. Como exemplo, temos certas espécies de mosquito que transmitem vírus ao picar os indivíduos doentes e, depois, os indivíduos saudáveis, espalhando a doença.
Atualmente foram identificadas aproximadamente 3.600 espécies de vírus, que podem infectar bactérias, plantas e animais, bem como se instalar e causar doenças no homem. Cada doença com particularidades quanto ao modo de transmissão, características da infecção e medidas profiláticas.
As doenças viróticas que mais acometem o organismo humano são as seguintes: Gripe, Catapora ou Varicela, Caxumba, Dengue, Febre Amarela, Hepatite, Rubéola, Sarampo, Varíola, Herpes simples e Raiva.
Por serem tão pequenos conseguem invadir células, inclusive a de organismos unicelulares, como as bactérias. É parasitando células de outros organismos que os vírus conseguem reproduzir-se. Como são parasitas obrigatórios eles causam nos seres parasitados doenças denominadas viroses.
Os vírus apresentam formas de organismo bastante diferenciadas, mas todos possuem uma cápsula feita de proteína, onde fica o material genético desses seres. Esse material genético sofre modificações, ou seja mutações, com frequência, levando ao surgimento de variedades (subtipos) de um mesmo vírus. Isso dificulta o seu combate e compromete a eficiência de várias vacinas, que são preparadas para combater tipos específicos de microorganismo. A capacidade de sofrer mutações genéticas é uma das características que os vírus têm em comum com os seres vivos.
Diferentes formas dos capsídeos dos vírus.
Os vírus só podem ser visualizados com o auxílio de microscópios eletrônicos, instrumentos disponíveis apenas em locais especializados, como centros de pesquisa, universidades e grandes laboratórios, e que podem mostrar imagens aumentadas em até centenas de milhares de vezes.
Imagem de um microscópio eletrônico mostrando o vírus HIV, formato circular.
Vírus e a saúde
A palavra vírus tem origem latina e significa "veneno". Provavelmente esse nome foi dado devido às viroses, que são doenças causadas por vírus.
O nosso corpo tem defesas naturais, como os anticorpos, que são proteínas produzidas por células especiais do sangue contra agentes causadores de doenças. A própria febre representa um mecanismo de combate as infecções, pois o aumento da temperatura ativa o metabolismo e acelera a reação dos glóbulos brancos. Quando a temperatura axilar ultrapassa 37,5 graus Celcius, porém, a pessoa deve ser tratada pelo médico. Além disso, contamos com produtos como vacinas, soros e alguns medicamentos antivirais (não confundir com antibióticos).
De modo geral, as viroses provocam mal-estar, dores e febre, mas cada virose tem seus sintomas próprios e pode ser mais ou menos grave.
Cada tipo de vírus "ataca" células específicas. O vírus da caxumba, por exemplo, parasita as células das glândulas salivares ou parótidas, provocando inchaço e dor nas laterais do pescoço.
Em algumas doenças, incluindo certas viroses, a transmissão depende da ação de um vetor. Esse termo se refere ao ser que não provoca por si mesmo a doença em outros seres, mas que, carrega no seu corpo o agente causador, podendo transmiti-lo. Como exemplo, temos certas espécies de mosquito que transmitem vírus ao picar os indivíduos doentes e, depois, os indivíduos saudáveis, espalhando a doença.
Atualmente foram identificadas aproximadamente 3.600 espécies de vírus, que podem infectar bactérias, plantas e animais, bem como se instalar e causar doenças no homem. Cada doença com particularidades quanto ao modo de transmissão, características da infecção e medidas profiláticas.
As doenças viróticas que mais acometem o organismo humano são as seguintes: Gripe, Catapora ou Varicela, Caxumba, Dengue, Febre Amarela, Hepatite, Rubéola, Sarampo, Varíola, Herpes simples e Raiva.
quinta-feira, 20 de janeiro de 2011
sexta-feira, 14 de janeiro de 2011
Aplicações das Técnicas de Engenharia Genética
•DNA recombinante(DNAr):
Investigação fundamental: torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular.
Obtenção de OGM: os OGM são organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem características vantajosas. Os OGM
■Os animais transgénicos, normalmente, são produzidos através de microinjecção de DNA de um determinado gene em células de um ovo fertilizado, ou através de células colocadas no útero de uma fêmea, decorrendo assim o seu desenvolvimento.
■Os OGM são utilizados para:
- produção de alimentos em maior quantidade e qualidade;- produção de grandes quantidades de substâncias com aplicação médica ou farmacêutica, como a insulina, hormona do crescimento ou factores de coagulação sanguínea;
- produção de substâncias com aplicação industrial;
- biorremediação – modificação de organismos no sentido de degradarem poluentes.
•DNA complementar (DNAc):
- Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse – torna possível a produção de proteínas humanas por procariontes que podem ser cultivados facilmente em biorreactores.
•PCR:
- Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.
•DNA fingerprint:
- Investigação criminal, forense e histórica – a técnica permite partir de material biológico deixado num local (cabelo, sangue, esperma...) e compará-lo com o dos suspeitos; permite a identificação de cadáveres.
- Determinação de paternidade – a comparação das impressões digitais genéticas dos progenitores e do descendente permite excluir a paternidade ou confirmá-la com um elevado grau de certeza.
•Há alguns obstáculos na expressão de genes eucariontes em bactérias.
- Deve associar-se o gene às sequências promotoras e reguladoras mais apropriadas e que possam ser reconhecidas pela RNA polimerase da bactéria (as zonas de regulação da expressão génica em procariontes são diferentes dos eucariontes).
■A resolução deste problema pode ser obtida pela combinação de uma determinada sequência nucleotídica com um promotor da própria bactéria, permitindo a expressão da sequência eucarionte inserida.
- Quando se transferem genes para uma bactéria, é aconselhável que o DNA transferido já esteja processado, uma vez que as bactérias hospedeiras não possuem enzimas para o processamento e remoção dos intrões, introduzindo uma cópia de DNAc do gene.
•A utilização e introdução no mercado dos OGM é um assunto controverso e que levanta problemas éticos. Apesar das vantagens associadas a estes organismos, o impacto que podem vir a ter sobre o ambiente e a saúde humana é desconhecido e imprevisível.
Investigação fundamental: torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular.
Obtenção de OGM: os OGM são organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem características vantajosas. Os OGM
■Os animais transgénicos, normalmente, são produzidos através de microinjecção de DNA de um determinado gene em células de um ovo fertilizado, ou através de células colocadas no útero de uma fêmea, decorrendo assim o seu desenvolvimento.
■Os OGM são utilizados para:
- produção de alimentos em maior quantidade e qualidade;- produção de grandes quantidades de substâncias com aplicação médica ou farmacêutica, como a insulina, hormona do crescimento ou factores de coagulação sanguínea;
- produção de substâncias com aplicação industrial;
- biorremediação – modificação de organismos no sentido de degradarem poluentes.
•DNA complementar (DNAc):
- Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse – torna possível a produção de proteínas humanas por procariontes que podem ser cultivados facilmente em biorreactores.
•PCR:
- Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.
•DNA fingerprint:
- Investigação criminal, forense e histórica – a técnica permite partir de material biológico deixado num local (cabelo, sangue, esperma...) e compará-lo com o dos suspeitos; permite a identificação de cadáveres.
- Determinação de paternidade – a comparação das impressões digitais genéticas dos progenitores e do descendente permite excluir a paternidade ou confirmá-la com um elevado grau de certeza.
•Há alguns obstáculos na expressão de genes eucariontes em bactérias.
- Deve associar-se o gene às sequências promotoras e reguladoras mais apropriadas e que possam ser reconhecidas pela RNA polimerase da bactéria (as zonas de regulação da expressão génica em procariontes são diferentes dos eucariontes).
■A resolução deste problema pode ser obtida pela combinação de uma determinada sequência nucleotídica com um promotor da própria bactéria, permitindo a expressão da sequência eucarionte inserida.
- Quando se transferem genes para uma bactéria, é aconselhável que o DNA transferido já esteja processado, uma vez que as bactérias hospedeiras não possuem enzimas para o processamento e remoção dos intrões, introduzindo uma cópia de DNAc do gene.
•A utilização e introdução no mercado dos OGM é um assunto controverso e que levanta problemas éticos. Apesar das vantagens associadas a estes organismos, o impacto que podem vir a ter sobre o ambiente e a saúde humana é desconhecido e imprevisível.
quinta-feira, 13 de janeiro de 2011
Fundamentos de Engenharia Genética
Fundamentos de Engenharia Genética
A Engenharia Genética permite manipular directamente os genes de determinados organismos com objectivos práticos.
Tecnologia de DNA recombinante
Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante (DNAr).
Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.
Enzimas de restrição – reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'.
- As enzimas de restrição são bastante específicas e ocorrem naturalmente em bactérias. Protegem as bactérias dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem e cortam sequências específicas do DNA viral, inactivando-o. O DNA bacteriano está protegido da actividade das enzimas de restrição.
- A actividade das enzimas de restrição dá origem a fragmentos de DNA em dupla hélice – fragmentos de restrição - com extremidades em cadeia simples – extremidades coesivas.
- Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de restrição obtidos com a mesma enzima.
As extremidades coesivas emparelham através de ligaçõe sde hidrogénio entre bases
complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a formação de ligações fosfodiéster.
Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma célula ou um organismo receptor.
- Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os bacteriófagos.
- Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias, leveduras e células vegetais.
- Os plasmídeos ligam-se a determinados compostos, tornando-os mais densos, permitindo a sua separação por centrifugação.
•Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:
1.Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.
2.A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
3.Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.
4.O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.
5.O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.
6.Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.
DNA Complementar - DNAc
Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como receptores de DNA estranho porque são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos bioquímicos bem conhecidos. No entanto, não processam o RNAm e, quando recebem genes com intrões, estes não são retirados e a proteína produzida não é funcional.
DNA complementar (DNAc) – molécula de DNA sem intrões que é directamente transcrita numa molécula de RNAm funcional. O processo de obtenção de DNAc é o seguinte:
1.Isola-se uma molécula RNAm funcional das células.
2.Adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos livres. A transcriptase reversa catalisa a síntese de uma cadeia simples de DNA a partir de um molde de RNAm.
3.Junta-se uma enzima que degrada o RNAm que serviu de molde e DNA polimerase que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA.
O DNAc pode ser inserido através de um vector contendo o promotor e sequências reguladoras.
Todos os DNAc que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactérias, originando uma biblioteca de DNAc, em que toda a informação (genes que se encontravam a ser transcritos – expressos – num dado momento), fica armazenada em bactérias por longos períodos de tempo, desde que sejam fornecidas todas as condições indispensáveis para a sua manutenção.
Reacção de Polimerização em Cadeia – PCR
Técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células.
•Material necessário:
- sequências de DNA que se pretende amplificar;
- um par de iniciadores (primers);
- os quatro tipos de nucleótidos;
- uma polimerase DNA (Taq);
- solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg² , ião essencial para a actividade da polimerase.
•Uma reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, envolvendo cada um destes ciclos:
- Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia;
- Emparelhamento dos iniciadores – diminuição da temperatura aproximadamente para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
- Polimerização (síntese) de DNA – ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.
- Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem intervenção manual. No final, leva à produção de 2^n moléculas de DNA de interesse, em que n representa o número de ciclos.
- A Taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).
•Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade à contaminação com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequências não pretendidas.
DNA Fingerprint
•No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
•Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à acção de um campo eléctrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de indivíduo para indivíduo.
A Engenharia Genética permite manipular directamente os genes de determinados organismos com objectivos práticos.
Tecnologia de DNA recombinante
Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante (DNAr).
Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.
Enzimas de restrição – reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'.
- As enzimas de restrição são bastante específicas e ocorrem naturalmente em bactérias. Protegem as bactérias dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem e cortam sequências específicas do DNA viral, inactivando-o. O DNA bacteriano está protegido da actividade das enzimas de restrição.
- A actividade das enzimas de restrição dá origem a fragmentos de DNA em dupla hélice – fragmentos de restrição - com extremidades em cadeia simples – extremidades coesivas.
- Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de restrição obtidos com a mesma enzima.
As extremidades coesivas emparelham através de ligaçõe sde hidrogénio entre bases
complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a formação de ligações fosfodiéster.
Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma célula ou um organismo receptor.
- Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os bacteriófagos.
- Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias, leveduras e células vegetais.
- Os plasmídeos ligam-se a determinados compostos, tornando-os mais densos, permitindo a sua separação por centrifugação.
•Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:
1.Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.
2.A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
3.Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.
4.O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.
5.O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.
6.Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.
DNA Complementar - DNAc
Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como receptores de DNA estranho porque são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos bioquímicos bem conhecidos. No entanto, não processam o RNAm e, quando recebem genes com intrões, estes não são retirados e a proteína produzida não é funcional.
DNA complementar (DNAc) – molécula de DNA sem intrões que é directamente transcrita numa molécula de RNAm funcional. O processo de obtenção de DNAc é o seguinte:
1.Isola-se uma molécula RNAm funcional das células.
2.Adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos livres. A transcriptase reversa catalisa a síntese de uma cadeia simples de DNA a partir de um molde de RNAm.
3.Junta-se uma enzima que degrada o RNAm que serviu de molde e DNA polimerase que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA.
O DNAc pode ser inserido através de um vector contendo o promotor e sequências reguladoras.
Todos os DNAc que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactérias, originando uma biblioteca de DNAc, em que toda a informação (genes que se encontravam a ser transcritos – expressos – num dado momento), fica armazenada em bactérias por longos períodos de tempo, desde que sejam fornecidas todas as condições indispensáveis para a sua manutenção.
Reacção de Polimerização em Cadeia – PCR
Técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células.
•Material necessário:
- sequências de DNA que se pretende amplificar;
- um par de iniciadores (primers);
- os quatro tipos de nucleótidos;
- uma polimerase DNA (Taq);
- solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg² , ião essencial para a actividade da polimerase.
•Uma reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, envolvendo cada um destes ciclos:
- Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia;
- Emparelhamento dos iniciadores – diminuição da temperatura aproximadamente para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
- Polimerização (síntese) de DNA – ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.
- Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem intervenção manual. No final, leva à produção de 2^n moléculas de DNA de interesse, em que n representa o número de ciclos.
- A Taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).
•Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade à contaminação com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequências não pretendidas.
DNA Fingerprint
•No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
•Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à acção de um campo eléctrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de indivíduo para indivíduo.
terça-feira, 11 de janeiro de 2011
Mutações (Parte II)
•Mutações Cromossómicas Estruturais:
Delecção
Falta uma porção de um cromossoma.
Pode ocorrer nas zonas terminais ou intersticiais da molécula de DNA.
Causa: cruzamento de cromossomas e quebra nos pontos de cruzamento, a que se segue uma reconstituição em que um segmento é eliminado.
Consequências/exemplos:
As delecções variam muito em tamanho, mas as maiores têm efeitos mais nefastos pois removem mais genes.
Duplicação
Existência de duas cópias de uma dada região cromossómica, frequentemente associada à delecção no correspondente cromossoma homólogo.
Os efeitos variam em função da extensão e do tipo de informação repetida.
Translocação
Transferência de segmentos entre cromossomas não homólogos.
Pode ser:
Translocação simples – transferência de um segmento de um cromossoma para outro não homólogo.
Translocação recíproca – troca de partes entre dois cromossomas.
Translocação robertsoniana – os braços longos de dois cromossomas acrocêntricos ligam-se formando um único cromossoma e os braços curtos são perdidos. Causada pelo cruzamento e quebra de cromossomas não homólogos ou pela perda dos telómeros.
Na translocação simples e na translocação recíproca, se não houver quebra de genes, o fenótipo não é afectado.
A translocação robertsoniana dá origem à formação de cromossomas anormais que são transmitidos à geração seguinte nos gâmetas. Cerca de 4% dos síndromes de Down estão associados a uma translocação robertsoniana entre o cromossoma 14 e o 21.
Inversão
Remoção de um segmento de DNA e inserção numa posição invertida num outro local do cromossoma.
A inversão pode ser:
paracêntrica – não inclui o centrómero;
pericêntrica – inclui o centrómero.
Causa: quebra de um cromossoma, seguida da sua reconstituição na orientação incorrecta.
As consequências de uma inversão dependem dos genes envolvidos
No caso de a inversão incluir parte de um segmento de DNA que codifica para uma proteína, esta será muito diferente e não funcional, na maioria das situações;
Certas inversões não têm efeitos sobre o fenótipo, mas causam problemas reprodutivos. O emparelhamento, na meiose, de um cromossoma com uma inversão com um cromossoma normal implica que um dos cromossomas tenha de se dobrar. O crossing-over nessa região pode originar duplicações ou delecções nos cromossomas recombinantes.
Síndromes Mais Comuns:
•Síndrome de Down
Trissomia 21 (47, XX + 21 ou 47,XY + 21)
É a aneuploidia mais viável no Homem.
Indivíduos de baixa estatura com uma morfologia das pálpebras característica, boca pequena e atraso mental em grau variável.
•Síndrome de Edwards
Trissomia 18
Atraso mental grave, malformações cardíacas e morfológicas. Raramente sobrevivem mais do que alguns meses.
•Síndrome de Patau
Trissomia 13
Malformações morfológicas e do sistema nervoso central graves. Atraso mental profundo. Raramente sobrevivem mais do que alguns meses.
•Síndrome de Turner
Monossomia X (45,X0), outros.
Infantilismo sexual (formação de ovários vestigiais),baixa estatura, pregas perigonucais, inteligência, geralmente, normal.
A maioria dos sintomas são mais notórios na puberdade, pelo que nesta idade, se as doentes não forem submetidas a um tratamento hormonal, não desenvolverão os caracteres sexuais secundários.
•Trissomia do X
47,XXX
Mulheres com estatura normalmente acima da média, frequentemente estéreis e com inteligência acima do normal.
•Síndrome de Klinefelter
47,XXY
Estatura grande, testículos e pénis pequenos, reduzida pilosidade púbica e seios salientes.
•Síndrome de Jacobs
47,XYY
Homens de elevada estatura, com desenvolvimento sexual normal e inteligência normal.
•Síndrome do Cri-du-Chat
Delecção do braço superior do cromossoma 5.
Deve o seu nome ao facto de os doentes afectados terem o choro idêntico ao miar de um gato.
Apresentam ainda atrasos mentais e neuromotores graves.
•Leucemia mielóide crónica
Translocação recíproca entre o cromossoma 9 e 22.
Consequências fenotípicas: fadiga acentuada, mal-estar abdominal, surdez, cegueira, outros.
Mutações e Oncogénese
•O cancro é uma doença genética que resulta da perda de controlo do ciclo celular. A divisão de uma célula com mais frequência do que o normal dá origem a uma população de células em proliferação descontrolada e forma uma massa de células ou tumor.
•Características das células cancerosas:
- são pouco especializadas (desdiferenciadas) e com forma arredondada;
- dividem-se continuamente;
- invadem os tecidos adjacentes;
- podem instalar-se noutros locais do organismo, onde chegam através da corresnte sanguínea ou linfática, originando novos tumores que se chamam metástases.
•Na maior parte das situações, as mutações ocorrem em células somáticas ao longo da vida, embora também possam ocorrer em células germinativas. Geralmente, é um acumular de mutações que desencadeia o desenvolvimento de um cancro.
Genes relacionados com o aparecimento de cancro e suas mutações:
Oncogenes:
- Resultam da mutação de proto-oncogenes.
- Os proto-oncogenes codificam proteínas que estimulam o crescimento e a divisão celular e têm uma função essencial nas células normais, por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário e na reparação de tecidos lesados.
- Quando indevidamente activados, promovem uma proliferação celular excessiva que conduz ao desenvolvimento de um cancro.
A activação de um oncogene pode resultar de diferentes tipos de mutações:
- Substituição de bases no DNA, e consequente alteração na sequência de aminoácidos da proteína formada, que resulta numa proteína com maior actividade ou resistente à degradação;
- Amplificação do proto-oncogene - Traduz-se numa maior quantidade do produto codificado pelo gene;
inversões ou translocações que levam à alteração do local que o proto-oncogene ocupa no genoma. Se o proto-oncogene for deslocado para junto de um gene activamente transcrito ou para junto de um DNA viral, a sua taxa de transcrição também aumenta.
Genes supressores de tumores:
- Os produtos destes genes contrariam o estímulo proliferativo dos proto-oncogenes através de uma acção inibidora;
- Os genes supressores de tumores podem estar na origem do cancro quando sofrem mutações como as seguintes:
delecções, que causam a sua perda;
substituição de bases do DNA que resulta numa proteína onde se verifica perda de função relativamente à proteína normal.
Genes que codificam proteínas reparadoras do DNA:
- As mutações nestes genes permitem a acumulação de outras mutações, algumas das quais em proto-oncogenes ou genes supressores de tumores.
•Os agentes mutagénicos podem activar oncogenes ou desactivar genes supressores de tumores e causar cancro.
•As infecções por vírus contribuem para o aparecimento de cancro pela integração do material genético do vírus no DNA das células afectadas. O DNA viral pode ser inserido num local onde destrua a actividade de um gene supressor de tumores ou converta um proto-oncogene num oncogene.
Delecção
Falta uma porção de um cromossoma.
Pode ocorrer nas zonas terminais ou intersticiais da molécula de DNA.
Causa: cruzamento de cromossomas e quebra nos pontos de cruzamento, a que se segue uma reconstituição em que um segmento é eliminado.
Consequências/exemplos:
As delecções variam muito em tamanho, mas as maiores têm efeitos mais nefastos pois removem mais genes.
Duplicação
Existência de duas cópias de uma dada região cromossómica, frequentemente associada à delecção no correspondente cromossoma homólogo.
Os efeitos variam em função da extensão e do tipo de informação repetida.
Translocação
Transferência de segmentos entre cromossomas não homólogos.
Pode ser:
Translocação simples – transferência de um segmento de um cromossoma para outro não homólogo.
Translocação recíproca – troca de partes entre dois cromossomas.
Translocação robertsoniana – os braços longos de dois cromossomas acrocêntricos ligam-se formando um único cromossoma e os braços curtos são perdidos. Causada pelo cruzamento e quebra de cromossomas não homólogos ou pela perda dos telómeros.
Na translocação simples e na translocação recíproca, se não houver quebra de genes, o fenótipo não é afectado.
A translocação robertsoniana dá origem à formação de cromossomas anormais que são transmitidos à geração seguinte nos gâmetas. Cerca de 4% dos síndromes de Down estão associados a uma translocação robertsoniana entre o cromossoma 14 e o 21.
Inversão
Remoção de um segmento de DNA e inserção numa posição invertida num outro local do cromossoma.
A inversão pode ser:
paracêntrica – não inclui o centrómero;
pericêntrica – inclui o centrómero.
Causa: quebra de um cromossoma, seguida da sua reconstituição na orientação incorrecta.
As consequências de uma inversão dependem dos genes envolvidos
No caso de a inversão incluir parte de um segmento de DNA que codifica para uma proteína, esta será muito diferente e não funcional, na maioria das situações;
Certas inversões não têm efeitos sobre o fenótipo, mas causam problemas reprodutivos. O emparelhamento, na meiose, de um cromossoma com uma inversão com um cromossoma normal implica que um dos cromossomas tenha de se dobrar. O crossing-over nessa região pode originar duplicações ou delecções nos cromossomas recombinantes.
Síndromes Mais Comuns:
•Síndrome de Down
Trissomia 21 (47, XX + 21 ou 47,XY + 21)
É a aneuploidia mais viável no Homem.
Indivíduos de baixa estatura com uma morfologia das pálpebras característica, boca pequena e atraso mental em grau variável.
•Síndrome de Edwards
Trissomia 18
Atraso mental grave, malformações cardíacas e morfológicas. Raramente sobrevivem mais do que alguns meses.
•Síndrome de Patau
Trissomia 13
Malformações morfológicas e do sistema nervoso central graves. Atraso mental profundo. Raramente sobrevivem mais do que alguns meses.
•Síndrome de Turner
Monossomia X (45,X0), outros.
Infantilismo sexual (formação de ovários vestigiais),baixa estatura, pregas perigonucais, inteligência, geralmente, normal.
A maioria dos sintomas são mais notórios na puberdade, pelo que nesta idade, se as doentes não forem submetidas a um tratamento hormonal, não desenvolverão os caracteres sexuais secundários.
•Trissomia do X
47,XXX
Mulheres com estatura normalmente acima da média, frequentemente estéreis e com inteligência acima do normal.
•Síndrome de Klinefelter
47,XXY
Estatura grande, testículos e pénis pequenos, reduzida pilosidade púbica e seios salientes.
•Síndrome de Jacobs
47,XYY
Homens de elevada estatura, com desenvolvimento sexual normal e inteligência normal.
•Síndrome do Cri-du-Chat
Delecção do braço superior do cromossoma 5.
Deve o seu nome ao facto de os doentes afectados terem o choro idêntico ao miar de um gato.
Apresentam ainda atrasos mentais e neuromotores graves.
•Leucemia mielóide crónica
Translocação recíproca entre o cromossoma 9 e 22.
Consequências fenotípicas: fadiga acentuada, mal-estar abdominal, surdez, cegueira, outros.
Mutações e Oncogénese
•O cancro é uma doença genética que resulta da perda de controlo do ciclo celular. A divisão de uma célula com mais frequência do que o normal dá origem a uma população de células em proliferação descontrolada e forma uma massa de células ou tumor.
•Características das células cancerosas:
- são pouco especializadas (desdiferenciadas) e com forma arredondada;
- dividem-se continuamente;
- invadem os tecidos adjacentes;
- podem instalar-se noutros locais do organismo, onde chegam através da corresnte sanguínea ou linfática, originando novos tumores que se chamam metástases.
•Na maior parte das situações, as mutações ocorrem em células somáticas ao longo da vida, embora também possam ocorrer em células germinativas. Geralmente, é um acumular de mutações que desencadeia o desenvolvimento de um cancro.
Genes relacionados com o aparecimento de cancro e suas mutações:
Oncogenes:
- Resultam da mutação de proto-oncogenes.
- Os proto-oncogenes codificam proteínas que estimulam o crescimento e a divisão celular e têm uma função essencial nas células normais, por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário e na reparação de tecidos lesados.
- Quando indevidamente activados, promovem uma proliferação celular excessiva que conduz ao desenvolvimento de um cancro.
A activação de um oncogene pode resultar de diferentes tipos de mutações:
- Substituição de bases no DNA, e consequente alteração na sequência de aminoácidos da proteína formada, que resulta numa proteína com maior actividade ou resistente à degradação;
- Amplificação do proto-oncogene - Traduz-se numa maior quantidade do produto codificado pelo gene;
inversões ou translocações que levam à alteração do local que o proto-oncogene ocupa no genoma. Se o proto-oncogene for deslocado para junto de um gene activamente transcrito ou para junto de um DNA viral, a sua taxa de transcrição também aumenta.
Genes supressores de tumores:
- Os produtos destes genes contrariam o estímulo proliferativo dos proto-oncogenes através de uma acção inibidora;
- Os genes supressores de tumores podem estar na origem do cancro quando sofrem mutações como as seguintes:
delecções, que causam a sua perda;
substituição de bases do DNA que resulta numa proteína onde se verifica perda de função relativamente à proteína normal.
Genes que codificam proteínas reparadoras do DNA:
- As mutações nestes genes permitem a acumulação de outras mutações, algumas das quais em proto-oncogenes ou genes supressores de tumores.
•Os agentes mutagénicos podem activar oncogenes ou desactivar genes supressores de tumores e causar cancro.
•As infecções por vírus contribuem para o aparecimento de cancro pela integração do material genético do vírus no DNA das células afectadas. O DNA viral pode ser inserido num local onde destrua a actividade de um gene supressor de tumores ou converta um proto-oncogene num oncogene.
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